تشخیص بروسلا ملیتنسیس به روش real-time pcr در نمونه های بالینی و دامی

جنس بروسلا، باکتری های درون سلولی اختیاری هستند که باعث ایجاد بیماری بروسلوزیس در انسان و دام می شوند. روش های تشخیصی مبتنی بر کشت با وجود آنکه استاندارد طلایی محسوب می شوند، حساسیت پایینی (تا 70%) دارند. آزمون های سرولوژیکی به دلیل ایجاد واکنش های متقاطع با سایر میکروارگانیسم ها و نبود الگوهای مناسب جهت تفسیر تیتر های آنتی بادی در مناطق اندمیک، قادر به رفع مشلات پیش روی تشخیص این بیماری نیستند. روش های مبتنی بر pcr با دارا بودن حساسیت و اختصاصیت بالا امکان تشخیص درست و سریع را فراهم کرده است. در این میان، real-time pcr روش نوینی است که با حذف بسیاری از فرایند های وقت گیر، امکان بررسی تولید محصول را در حین انجام واکنش میسر ساخته است. استفاده از پروب taqman موجب افزایش اختصاصیت واکنش می شود. با پیشرفت واکنش و تولید محصول، مقدار پروب بیشتری توسط آنزیم dna-پلیمراز تجزیه می شود و در نتیجه تابش فلورسانس افزایش می یابد و در نهایت توسط دستگاه real-time pcr شناسایی می شود. هدف ما در پروژه ی حاضر طراحی quantitative taqmn real-time pcr بود که علاوه بر شناسایی، توانایی سنجش کمی بروسلا در نمونه های بالینی را نیز دارا می باشد. پس از طراحی پرایمر ها بر اساس ژن bcsp 31، ارزیابی آن تو سط pcr معمولی و سپس sybr green real-time pcr صورت گرفت. پس از تأیید پرایمر ها، یک پروب taqman در فاصله ی 16 نوکلئوتیدی پرایمر بالادست طراحی و بهینه شد. از پلاسمید pjet کلون شده با قطعه ی مورد نظر که توسط آنزیم hind iii به صورت خطی درآمده بود، برای تهیه ی منحنی استاندارد استفاده شد. نتایج ما با استفاده از سویه های استاندارد حساسیت 10 فمتوگرم (معادل سه باکتری بروسلا) و با 14 سویه ی غیربروسلایی اختصاصیت 100% را نشان داد. با استفاده از این سیستم طراحی شده، 25 نمونه ی سرم انسانی و 75 نمونه ی سرم دامی که از لحاظ آزمون سرولوژی رایت مثبت بودند مورد آزمون قرار گرفتند که به ترتیب در 72% و 3/61% موارد مثبت شدند.